Palestrante
Descrição
As leishmanioses são doenças negligenciadas causadas por parasitos do gênero Leishmania. Os tratamentos disponíveis apresentam limitações, como toxicidade elevada, número restrito de fármacos e surgimento de resistência, evidenciando a necessidade de novos alvos terapêuticos. A fosfolipase do tipo patatina (PNPLA), foi identificada como diferencialmente expressa em linhagens de L. infantum resistentes ao antimônio. A PNPLA atua na hidrólise de fosfolipídios de membrana, podendo influenciar processos relacionados à adaptação, infectividade e resistência a fármacos. Diante disso, este trabalho tem como objetivo avaliar o impacto da deleção e da superexpressão do gene PNPLA em L. infantum, caracterizando o genótipo e o fenótipo dos parasitos mutantes quanto ao crescimento, susceptibilidade a fármacos, resposta ao estresse e infectividade in vitro. Para a deleção do gene de cópia única PNPLA (LINF_340035800) em L. infantum por CRISPR/Cas9 foi utilizada a linhagem Li::Cas9::tdTomato, que expressa SpCas9, RNA polimerase T7 e a proteína fluorescente vermelha tdTomato. A linhagem Li::Cas9::tdTomato foi transfectada com cassetes de DNA doador e moldes de sgRNA direcionados ao gene PNPLA. Todos os iniciadores necessários para essas amplificações foram desenhados usando o LeishGEdit. As modificações genéticas dos parasitos transfectados foram confirmadas por PCR. As tentativas de obtenção de mutantes nocaute para o gene PNPLA não foram bem-sucedidas. Os parasitos transfectados sobreviveram após a seleção com neomicina (NEO) e puromicina e, embora tenha sido confirmada a integração dos marcadores de resistência no locus alvo, observou-se a manutenção do gene PNPLA. Esse resultado sugere que PNPLA é essencial para a viabilidade do parasito, sendo provável que cópias adicionais do gene tenham sido mantidas por aneuploidia ou amplificação gênica, mecanismos frequentemente associados à plasticidade genômica em Leishmania. Foi possível obter parasitos com deleção de apenas um alelo, evidenciada pela integração do marcador de resistência NEO no locus de PNPLA, caracterizando linhagens heterozigotas. As próximas etapas incluem a caracterização genotípica e fenotípica desses mutantes, bem como uma nova tentativa de deleção completa por meio de estratégia de complementação epissomal do gene previamente à edição gênica por CRISPR/Cas9. Esses resultados contribuirão para elucidar a função biológica da PNPLA e avaliar seu potencial como alvo terapêutico em Leishmania.
| Palavras-chave | Leishmania infantum; fosfolipase tipo patatina; resistência a fármacos; CRISPR/Cas9. |
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| Em qual formato você prefere apresentar seu trabalho? | Pôster |
| Deseja concorrer à premiação de melhores trabalhos? | Sim |
| O seu trabalho se encaixa em qual dos 20 Objetivos de Desenvolvimento Sustentável (ODSs)? | 3. Saúde e Bem-Estar |